66江苏麻将|乐趣江苏麻将新版本

只需通過簡單的一滴血就能成功的檢測腫瘤,并且針對腫瘤患者快速確定一項治療方案是否適合,還可以繼續監測該治療方案在癌細胞產生耐藥之后的效果。這就是曾經榮登2015年度MITTechnology Review十大突破技術榜單的“液體活檢”技術!而循環腫瘤DNA(circulatingtumor DNA, ctDNA)檢測便是“液體活檢”技術之一。

那到底什么是ctDNA?有什么用?能干什么?適用于哪些人?本文將以頭頸腫瘤為例,詳細介紹ctDNA在臨床腫瘤的診斷、用藥指導、腫瘤進展檢測及預后等方面的應用。

一、ctDNA背景

1、ctDNA臨床意義及應用范圍

腫瘤細胞破裂后,細胞中的DNA釋放到血液中,這些DNA被稱為循環腫瘤DNA(ctDNA),與胎兒DNA可進入母體外周血類似。這些DNA片段攜帶有相對完整的癌細胞基因組變異信息,包括SNP(點突變)、InDel(插入缺失)、CNV(拷貝數變異)、fusion(融合基因)等。因此,ctDNA可以全面反映癌組織的DNA變異情況。

表一.ctDNA研究進展

只需通過簡單的一滴血就能成功的檢測腫瘤的ctDNA檢測方案 健康周刊 第1張

檢出腫瘤類型:結直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、頭頸癌和肝癌等

Dawson等[2]研究發現,ctDNA檢測作為一種無創的檢測方法,能夠真實的反應實體腫瘤組織中的基因突變圖譜和頻率,是治療效果的評估及治療后臨床隨訪的重要檢測指標,尤其在一些有典型臨床癥狀、檢查卻無特異性以及診斷困難的腫瘤中,可以避免復雜的、有創傷性的活檢,也能避免穿刺活檢所導致的腫瘤轉移風險。

2、目前ctDNA的主要檢測手段和缺陷

ctDNA檢測突變的最大難題是:眾多超低頻突變。含有突變的ctDNA僅占cfDNA的0.01-1%,在晚期癌癥中也僅能達到10%左右的量級,因此如何在大量正常DNA中分辨出超低頻突變就成為了一大難題。

 表二.各大類技術的檢測突變下限


之所以難以繼續下探的原因主要是由于PCR體系中的“馬太效應”,即含有低頻突變的片段在幾十個PCR擴增循環中會被占絕對主導地位的正常版本片段所掩蓋掉。針對ctDNA超低頻突變特點,目前只有數字PCR(DigitalPCR, dPCR)和暴力測序法可能達到更低的檢測下限。

dPCR的原理是將溶液模板分成大量小液滴,分配到不同的反應單元,再分別進行PCR擴增,檢測陽性液滴數量,根據泊松分布進行絕對定量(圖一)。這種方法的優點是可以避免低頻突變信號被淹沒在大量正常信號中,缺點是通量低,一次只能檢測一個位點,而且儀器價格昂貴。


隨后發展的BEAMing技術,是一種增強型dPCR。原理是在磁珠上進行dPCR后,利用熒光探針來區分基因是否發生突變,再用流式細胞儀分析熒光分布(圖二)。這種增強型dPCR方法使得PCR定量更準確,也可以實現同時檢測少量幾個位點,而缺點是價格比普通的dPCR還貴,且還需要流式細胞儀。


TAm-seq技術,即標記擴增深度測序,是使用標記擴增之后進行高達10000×以上的超深度測序(圖三)。這種方法理論上可以檢測出非特定的極低頻突變,但是成本非常高。加上此方法是進行兩次PCR擴增,增大了其偏好性(圖一左邊的情形),并且不可避免的出現測序儀器誤差,對算法要求極高,因此實際的穩定檢出下限只有1-2%左右。

只需通過簡單的一滴血就能成功的檢測腫瘤的ctDNA檢測方案 健康周刊 第2張

此外,癌癥個體化深度測序(CAPP-seq)技術[3]為了解決多位點、高偏好性下測序成本高的問題,則采取盡量減少檢測位點數量策略。此策略首先對腫瘤組織的外顯子組或者全基因組進行測序,獲得個體特有的腫瘤突變,再根據此分析結果設計少量的檢測位點進行ctDNA深度測序。且不說此技術的優點,單從“液體活檢”、“無創活檢”理念出發,CAPP-seq技術就不符合要求,因為CAPP-seq技術首先要求對腫瘤組織進行測序,這就使得個體定制化商業成本非常高。

另外,ctDNA的保存和提取也是ctDNA檢測突變所面臨的另一個挑戰。首先采血的保存和運輸遇到的冷凍問題導致提取量極不穩定;而保存運輸以及血漿的制備過程中出現的微量溶血也會造成提取ctDNA失敗,即使使用昂貴的專用ctDNA采血管,實測溶血率也很高。

二、技術發展更新

針對目前國內外對ctDNA的檢測手段存在的困難,有相關企業經過不斷鉆研、創新,給出了一個強有力的解決方案,結合ddPCR(DropletDigital PCR)系統的低偏好性和大規模測序的多重位點檢測能力和未知突變的檢測能力,自主研發的低成本ctDNA提取和保存方法,以及高精度全自動化的云平臺,使得ctDNA的檢測難題迎刃而解。

1、低偏好性RaindanceddPCR系統擴增

采用RaindanceddPCR系統。ddPCR系統的靈敏度主要由液滴數量和液滴體積兩個參數共同決定,液滴數量越多、液滴體積越小,系統的性能就越高。與傳統的Bio-rad系統20000個液滴相比Raindance擁有800倍的液滴數量(總共1600萬液滴),可以檢測更高的動態范圍以及更低的檢測下限。而相比于Bio-rad850pL的液滴體積,Raindancedd PCR液滴體積要小得多(4.4pL),可以提高局部模板濃度,提高擴增效率,同時檢測更多的位點(圖四)。此外,Raindance目前還推出2款配套試劑盒,在樣本起始量低至10ngDNA的情況下,即可使97%的序列覆蓋度達到500×,實現對FFPE、組織樣品中50個腫瘤基因序列(230對擴增引物)和血液中49個腫瘤基因序列(548對擴增引物)進行靶向富集和分析,內容全面,覆蓋度高,例如AML、MDS、MPN等,還包括比較難檢測的CEBPA和NOTCH1基因等。

此外,Raindance ddPCR系統的試劑兼容性較好,可與Raindance儀器生產廠家建立合作關系,取得其技術支持,在定制開發方面打造優勢。

2、測序和分析策略

采用Illumina/ion平臺,根據不同的測序目的進行測序策略調整以及測序平臺的選擇:偏重科研性質、對成本較為敏感的可選擇Illumina平臺;偏重臨床應用,對速度較為敏感的可選擇iontorrent平臺。根據目標需求,可實現單位點或多位點同時測序,且可覆蓋臨近區段,檢測未知突變。

依托高精度FANSe系列算法,可保證測序數據分析的可靠性,利用基因云分析平臺實現快速自動化分析,操作簡便,價格更實惠。

3、低成本cfDNA穩定保存和提取

采用創新的促凝管方法提取cfDNA,可低成本的穩定保存和提取cfDNA。試驗低成本cfDNA穩定保存和提取方案,若以懷孕<8周孕婦外周血為例,胎兒DNA在母體cfDNA中的比例在0.5%以下情況下,利用自主研發的促凝管方法檢測男嬰的Y染色體基因座(多重PCR)。結果發現,該低成本方案,cfDNA冷藏2周后提取無降解,較難擴增的第2、3管效果甚至明顯好于傳統當場立即提取方案。

參考文獻 

[1]Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, Wang Y, Agrawal N, et al. Detectionof circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sciencetranslational medicine. 2014;6:224ra24.

[2] Dawson SJ,Tsui DW, Murtaza M, Biggs H, Rueda OM, Chin SF, et al. Analysis of circulatingtumor DNA to monitor metastatic breast cancer. The New England journal ofmedicine. 2013;368:1199-209.

[3] Newman AM,Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, et al. An ultrasensitivemethod for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.Nature medicine. 2014;20:548-54.



文章標簽:ctDNA檢測方案ctDNA


發布評論:

為你推薦

需求提交

  • 您需要的服務模塊(可多選)

  • 您的信息僅用于國康需求提交,將嚴格被保護,
    國康承諾不泄露信息給任何第三方。

最新內容
熱門標簽
醫養醫養管家名醫問答疾病問答醫養問答健康問答糖尿病乙肝高血壓長沙私人醫生長沙名醫長沙家庭醫生痛風濟南私人醫生濟南名醫濟南家庭醫生甲亢西安私人醫生西安名醫西安家庭醫生
客戶評價

國康的模式很獨特,服務質量也抓得很嚴,確實解決了我們高管團隊很多健康問題。

騰訊創始人馬化騰

未來的一切都在云端,愛和良知永遠不變,國康的服務很有愛。

金蝶創始人徐少春

健康的人力資源是時代集團的重要企業資產,我們選擇了國康私人醫生服務為團隊的健康保障,他們的健康管家非常專業貼心,高效的為我們解決了大病的治療和預防問題,很有價值。

時代集團總裁王小蘭

國康提供的專業就醫、企業保健等閉環服務很有價值,大大減少了員工外出就醫的時間并降低了員工患病風險,增強了員工的歸屬感和幸福感。

微眾銀行行長李南青

有了國康的服務,自已健康有了保障。現在能把更多的精力和時間投入到工作與生活中去,真是解決了很多問題!

旭輝董事長林中

有了國康,我們也像西方家庭一樣,有了自己的健康守門人了。

杰克總裁阮積祥

2019

07/31

分享

國康健康管理,匯聚全球名醫

? 2019 國康私人醫生健康管理集團. All Rights Reserved.

粵ICP備13080796號-2

66江苏麻将 j江西时时走势 cp10acom彩拾官网下载 pk10技巧猜冠军玩法 陕西快乐十分直播软件 香港马会全年资枓2019 时时彩开奖开结果 云南11选5最大遗漏 湖北快三形态走势图一定牛一 平肖走势2 欢乐生肖平台